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venerdì 27 novembre 2015

La trasformazione genetica nella vite e nel pesco: applicazioni, benefici e rischi

Bruno Mezzetti, Silvia Sabbadini, Oriano Navacchi, Tiziana Pandolfini


Introduzione

Grandi progressi sono stati ottenuti in agricoltura durante gli anni settanta grazie alla così detta green revolution e ai molteplici risultati ottenuti attraverso il miglioramento genetico classico, tuttavia risulta evidente che ulteriori aumenti di produttività e qualità delle colture possono essere ottenuti in futuro principalmente attraverso l’uso dell’ingegneria genetica in agricoltura.
Nelle piante, l’ingegneria genetica viene utilizzata per trasferire nella specie di interesse uno o più geni che possano conferire caratteristiche agronomiche favorevoli. Per il trasferimento del materiale genetico vengono applicati specifici protocolli di trasformazione e rigenerazione, in genere ottimizzati per le singole specie e varietà di interesse. In vite l’utilizzo di un approccio transgenico permette di modificare tratti come la resistenza a malattie, migliorare la qualità e la produzione con la possibilità di cambiare solo il tratto di interesse mantenendo le caratteristiche delle diverse cultivar. Per il trasferimento dei geni in pianta: innanzitutto occorre isolare e caratterizzare i geni di interesse che codificano per tratti utili e avere un sistema di trasformazione e rigenerazione valido (Vivier et al., 2000). Per quanto riguarda la disponibilità di geni di interesse gli studi già approfonditi sul genoma della pesco e dalla vite offrono un’ampia disponibilità di informazioni che permettono l’identificazione di sequenze geniche utili per controllare diversi caratteri importanti la cui funzione deve essere però validata con esperimenti che comprendono anche la stessa trasformazione genetica. Per quanto riguarda il metodo di trasformazione, il pesco e la vite sono però considerate specie recalcitranti a causa delle difficoltà di mettere a punto un protocollo di rigenerazione e selezione efficiente per le diverse varietà e portinnesti di queste specie (Perl e Eshdat, 1998). I metodi di trasformazione genetica più utilizzati in vite sono la trasformazione mediata da Agrobacterium tumefaciens e il bombardamento con microproiettili, che costituisce la tecnica biolistica. Il pesco risulta ancora più difficile da rigenerare e i risultati di trasformazione genetica sono ancora molto limitati. Scopo di   questo gruppo di lavoro da anni   è quello di sviluppare nuovi protocolli di rigenerazione e trasformazione più efficienti per queste specie così da applicarli per le tecnologie genetiche innovative utile a risolvere il problemi anche molto importanti che affliggono la sostenibilità produttiva e la qualità di questi prodotti per la nostra agricoltura.

Il silenziamento genico post-trascrizionale: principi, meccanismo e applicazione per indurre resistenza a virus in piante da frutto

L’uso delle tecnologie del DNA ricombinante ha incontrato l’avversione dell’opinione pubblica in Europa, ma lo sviluppo di protocolli innovativi con l’uso di geni vegetali omologhi o di brevi sequenze non codificanti delle specie patogene ha ridotto gli ostacoli posti dall’opinione pubblica e aperto la via alla produzione di varietà resistenti per mezzo dell’ingegneria genetica. 
Le cellule eucariotiche possiedono un meccanismo di regolazione dell'espressione genica detto RNA silencing, nelle piante conosciuto come silenziamento genico post-trascrizionale (PTGS). Il fenomeno è innescato da molecole di RNA a doppio filamento (dsRNA) che, grazie all'azione di un enzima chiamato DICER-like (DCL), vengono tagliate in frammenti di RNA (sRNA) di lunghezza pari a 19-24 nucleotidi (Fig.1a). Questi piccoli RNA sulla base dell'omologia di sequenza, guidano il taglio di un RNA bersaglio, come ad esempio RNA derivante dalla replicazione di un virus all’interno della cellula vegetale. Nelle piante, il PTGS è stato studiato come meccanismo naturale di difesa contro le infezioni virali (Ding e Voinnet, 2007). Infatti, in seguito ad un’infezione virale, molecole di RNA a doppio filamento si originano come conseguenza della replicazione del virus. Questi dsRNA sono in grado di attivare il meccanismo del PTGS, portando ad una riduzione o una compromissione della replicazione del virus stesso (Voinnet 2005; Eamens et al, 2008). 
Da queste conoscenze si sono sviluppate nuove strategie basate sull'attivazione del RNA silencing, che sono state ampiamente utilizzate in studi di genomica funzionale e nel campo delle biotecnologie applicate a specie d’interesse agrario sempre per indurre resistenza a virus (Frizzi e Huang, 2010, Jagtap et al., 2011, Molesini et al., 2012), oppure anche per altri importanti caratteri, quali ad esempio la maturazione dei frutti, per la rimozione di allergeni o di proteine a basso livello nutrizionale, o anche per l’ottenimento di frutti partenocarpici. Un approccio molto efficace per indurre tale meccanismo in pianta è l'utilizzo di costrutti genici a “forcina” (hpRNA) (Fig. 1b) che una volta espressi, generano molecole di RNA a doppio filamento omologhe al trascritto che s’intende silenziare (Yan et al., 2006). Per quanto riguarda la resistenza a virus, costrutti a forcina antivirali contengono brevi sequenze del genoma virale poste in orientamento invertito e separate da una sequenza non codificante. Nelle piante, tali molecole di dsRNA vengono tagliate da enzimi del tipo DICER (DCL) in piccoli RNA (detti sRNAs) di lunghezza pari a 20-21 nucleotidi e di sequenza omologa al genoma virale. La strategia del PTGS è stata applicata con successo in diverse specie d’interesse agrario per indurre resistenza agli agenti virali (Waterhouse et al., 1998, Simon-Mateo and Garcia, 2011); come ad esempio nel caso di resistenza a PPV ottenuta sia in specie modello (Nicotiana benthamiana) (Pandolfini et al. del 2003, Di Nicola-Negri et al., 2010) e anche in una varietà di susino (Hily et al., 2007). Nel caso degli agrumi, costrutti a forcina contenenti sequenze ripetute e invertite omologhe alla porzione 3'-terminale del genoma del Citrus tristeza virus (CTV), hanno permesso di ottenere un buon livello di resistenza all'infezione da CTV nel lime messicano (Lopez et al., 2010). Per quanto riguarda i virus che attaccano la vite, in questo momento, gli esempi di resistenza ottenuti mediante PTGS sono limitati a specie modello (Ling. et al, 2008; Jardak-Jamoussi et al, 2009).
Figura 1. Modello illustrato di PTGS mediato da dsRNA prodotti da virus (a) 
o da costrutti a forcina (hpRNA) (b) (modificata da Waterhouse and Helliwell,2003).
Diffusione sistemica del segnale di silenziamento: un approccio transgenico per produrre piante da frutto non trasformate resistenti a virus?

Il PTGS è un processo in grado di diffondersi sia localmente tra cellula e cellula, sia a livello sistemico attraverso il sistema vascolare delle piante (floema) (Yoo et al., 2004; Tournier et al., 2006). E' stato recentemente dimostrato che sono i piccoli RNA (sRNA) le molecole segnale coinvolte nella trasmissione sistemica (Dunoyer et al, 2010;. Molnar et al., 2010; Melnyk et al, 2011). Tale passaggio di molecole segnale a livello sistemico è stato anche dimostrato tra il portainnesto e la marza in specie orticole (Kanehira et al., 2010; Kragle, 2010; Harada 2010). Sfruttare il movimento di molecole segnale a sRNA attraverso il sistema vascolare può permettere lo sviluppo di portinnesti transgenici su cui innestare varietà non transgeniche a cui vengono trasferiti i segnali molecolari capaci di indurre resistenza, così da avere una pianta interamente resistente ma geneticamente modificata solo nelle radici (Fig.2 A-B).
Figura 2. Differenti strategie di difesa a virus: A) una varietà geneticamente modificata (nesto GM) che esprime 
un costrutto a forcina inducente il silenziamento genico; B) portinnesto geneticamente modificato (nesto non-GM) esprimente un costrutto a forcina inducente il silenziamento genico sistemico (modificata da Lemgo et al., 2013).
L'approccio basato sul PTGS può essere applicato a colture legnose permettendo la produzione di piante in cui il portainnesto è geneticamente modificato (GM) mentre la marza è ottenuta da cultivar non transgeniche. Tale applicazione è di grande interesse per le colture arboree da frutto, in particolare per le drupacee, che sono propagate tramite innesto. Le piante transgeniche che esprimono costrutti a forcina volti a creare una resistenza a specifici virus, non contengono proteine nuove poiché il transgene è solamente trascritto, generando solo piccole molecole di RNA omologhe al trascritto virale che s’intende silenziare, ma non tradotto. Non si formano quindi proteine ed enzimi nuovi che devono essere studiati per il loro livello di sicurezza (Lemgo et al., 2013). 

Esempi di conferimento di resistenza ai virus della vite tramite tecniche di ingegneria genetica


Tra le principali aree di studio nel miglioramento genetico della vite possiamo includere la gestione delle malattie e lo sviluppo e la qualità delle bacche. La vite è esposta a molti stress biotici causati da insetti dannosi, funghi, batteri, citoplasmi e virus, che sono responsabili di elevate perdite economiche e richiedono l’utilizzo di prodotti agrochimici a livello estensivo. Le piante hanno evoluto una serie di meccanismi per contrastare gli attacchi da parte di batteri, patogeni fungini, virus e insetti. La parete cellulare è la prima linea di difesa contro l’ambiente esterno, quindi le piante hanno sviluppato dei sistemi di percezione e di difesa contro le modificazioni sia meccaniche che chimiche associate alla penetrazione del patogeno. In vite, come nella maggioranza delle piante, la deposizione di lignina insieme ad altri componenti fenolici, accompagnati da un’alta attività perossidasica e la produzione di fitoalessine rappresentano componenti importanti della risposta di difesa innata (Kortekamp, 2006). I sistemi di difesa attiva invece sono solitamente mediati da geni di resistenza della pianta (geni R) (Jones e Dangle, 2006; Robatzek e Bittel, 2007). La difesa delle piante dalle malattie richiede lo sviluppo di nuovi strumenti di lotta da impiegare in strategie alternative all’utilizzo di prodotti chimici che comportano un elevato rischio per l’ambiente e per la salute dei consumatori, le biotecnologie possono contribuire a creare varietà resistenti. Per quanto riguarda l’applicazione dell’ingegneria genetica al miglioramento della qualità delle bacche, i pochi esempi presenti in letteratura riguardano principalmente gli aspetti riguardanti lo sviluppo del colore, il metabolismo degli zuccheri e l’apirenia nelle varietà di uva da tavola (Perl et al., 2000). 

Negli anni tra il 1980 e 1990, il successo dell’ingegneria genetica nello sviluppo di piante resistenti a virus, ha annunciato una nuova era nel controllo delle malattie virali (Fuchs e Gonzalves, 2007). Infatti numerosi esperimenti dimostrarono che era possibile conferire resistenza a virus tramite l’espressione in pianta di costrutti contenenti geni virali interi o porzioni troncate di geni virali, come ad esempio geni codificanti per le proteine del capside, RNA polimerasi RNA dipendente, proteine del movimento ecc. Tra i primi esempi si possono citare i lavori di Powel e collaboratori (Powel et al., 1986) che riguardavano esperimenti con piante di tabacco che esprimevano la proteina di rivestimento del virus del mosaico del tabacco (TMV, Tobacco Mosaic Virus). Le piante transgeniche, mostravano quando venivano inoculate con il virus, un ritardo nell'espressione dei sintomi rispetto alle piante di controllo non trasformate. Successivamente i risultati di Powell vennero confermati in altre specie e fu anche dimostrato che piante transgeniche che esprimevano il gene della proteina di rivestimento di un virus potevano acquisire resistenza non solo nei confronti di quel virus, ma anche verso virus che presentavano elevate omologie di sequenza nel gene per la proteina di rivestimento (Fuchs e Gonzalves, 2007). I primi tentativi di indurre resistenza ai virus della vite utilizzarono costrutti genici senso o antisenso contenenti sequenze omologhe a regioni dei geni per le proteine capsidiche, geni della RNA polimerasi RNA-dipendente o geni di proteine di movimento. Queste strategie venivano adottate con lo scopo di bloccare il ciclo vitale e riproduttivo del virus, rendendo così la pianta transgenica resistente. Molti di questi lavori hanno descritto la trasformazione di piante modello come N. benthamiana e solo in pochi casi è riportato il trasferimento dei costrutti antivirali anche in portainnesti o cultivar di vite. Ciò è dovuto alla difficoltà intrinseca di trasformazione e rigenerazione di questa specie e ai tempi lunghi per arrivare a condurre gli esperimenti di resistenza sulle piante ambientate. 

Bardonner e collaboratori (1994) hanno riportato un significativo ritardo nell'infezione sistemica di GFLV, nelle piante di N. benthamiana che esprimevano il gene della proteina del capside; ma non fu osservata nelle piante transgeniche resistenza incrociata nei confronti di ArMV. Alti livelli di resistenza nei confronti di GFLV furono riportati anche da Monier e collaboratori (Monier et al., 2000) in piante transgeniche di N. benthamiana che esprimevano sequenze non traducibili del gene della proteina del capside di GFLV. Gambino e collaboratori (2010) trasformarono otto linee di vite con il gene della proteina del capside di GFLV e analizzarono i trasformanti cercando una correlazione tra l'espressione del transgene, la produzione di siRNA e la metilazione del DNA. Nel caso del silenziamento genico si può infatti avere inibizione della trascrizione dovuta alla metilazione del DNA prodotta per azione dei siRNAs. In tre linee di vite che non esprimevano il transgene fu osservata metilazione della citosina nella sequenza contenente il gene della proteina del capside, nel terminatore T7 della sequenza e nel promotore 35S e nessuna produzione rilevabile di siRNA. Dopo inoculo con il virus non si sono osservate variazioni nel livello di metilazione della citosina, ma piante transgeniche e non, mostravano una produzione di siRNA, da 21–22 nucleotidi, indicando cosi che le piante stavano rispondendo all'infezione virale, attivando un meccanismo di silenziamento post-trascrizionale. L’inibizione dell’espressione del transgene, probabilmente causata dalla metilazione del suo DNA, potrebbe spiegare perché le piante transgeniche innestante sopra portainnesti infettati con il virus non erano in grado di impedire la trasmissione del virus. A questo riguardo risulta interessante nell’ambito della trasformazione della vite il lavoro di trasformazione genica e successiva caratterizzazione molecolare eseguito da Maghuly et al., 2006. In questa ricerca sono state ingegnerizzate, attraverso una trasformazione mediata da A. tumefaciens, piante della varietà Russalka (Vitis vinifera) per la resistenza al virus GFLV tramite l’introduzione di differenti costrutti contenenti il gene codificante per la proteina capsidica del virus (gene GFLV CP) o forme non traducibili o tronche. L’interesse di tale lavoro è legato al fatto che dalla caratterizzazione molecolare più del 46% delle linee transgeniche testate hanno rivelato la presenza di una sola copia del costrutto; risultato importante visto che bassi livelli d’espressione sembrano essere correlati ad un elevato numero di copie del transgene inserite e dunque, al fenomeno del “gene-silencing” (Flavell, 1994; Vaucheret et al., 1998). Tuttavia, i risultati delle prove di infezione per determinare quali delle linee mostrassero un fenotipo resistente, non sono state fino ad ora pubblicate. Nel caso del lavoro di Jardak-Jamoussi (Jardak-Jamoussi et al., 2009) venne sviluppato un costrutto a forcina (costrutto ad hairpin o ad inverted repeats) per l’induzione del silenziamento ad RNA. Il costrutto conteneva una ripetizione invertita composta da sequenze derivate di GFLV, per il conferimento in vite di resistenza nei confronti della sindrome dell'arricciamento fogliare. Il costrutto, contenente frammenti di una regione conservata del gene della proteina del movimento di GFLV, presente in un isolato tunisino, fu trasferito in N. benthamiana mediante l'utilizzo di A. tumefaciens. La prova di infezione delle piante di N. benthamiana della generazione T1 ha mostrato nelle piante transgeniche resistenza, ritardo nell'infezione, ma anche casi di suscettibilità in alcune linee. Attraverso l’analisi northern blot, utilizzando come sonda una sequenza derivata da virus, è stato possibile individuare, dopo infezione con GFLV, specifici siRNA nelle piante trasformate resistenti di N. benthamiana, a conferma che la resistenza era dovuta ad un meccanismo di silenziamento ad RNA. Inoltre cellule embriogeniche di vite furono trasformate con lo stesso costrutto, usando A. tumefaciens. Attraverso northern blot furono rilevati differenti livelli di espressione del transgene in linee indipendenti di viti trasformate, indicando la presenza di silenziamento genico. Nell’articolo tuttavia non vengono descritti esperimenti per valutare il grado di resistenza al virus delle viti transgeniche. 

Per quanto riguarda la resistenza a GLRaV, Ling e collaboratori (Ling et al., 2008), trasformarono piante di N. benthamiana, inserendo il gene virale della proteina del capside di GLRaV-2. La resistenza al virus è stata poi valutata sulle piante transgeniche facendo delle prove di infezione con GLRaV-2, ed effettivamente le piante risultavano resistenti al virus. L’analisi dell’espressione della proteina del capside, eseguita tramite northern blot ha dimostrato che la resistenza nei confronti del virus nelle piante trasformate era associata a bassi livelli del trascritto del transgene. 

Un diverso approccio per il conferimento di resistenza al GFLV e ArMV è stato utilizzato da Nolke e collaboratori (Nolke et al., 2009). L’obiettivo del loro lavoro è stato quello di utilizzare anticorpi monoclonali diretti contro la proteina del capside di GFLV che mostravano reattività incrociata nei confronti di Arabis mosaic virus. È stato prodotto un costrutto esprimente un frammento anticorpale a singola catena posto sotto il controllo del promotore CaMV35S, con l’obiettivo di creare piante transgeniche di N. benthamiana. Dall’esperimento si notò che le piante delle generazioni T1 e T2 mostravano resistenza parziale o completa nei confronti dell'agente patogeno virale; la resistenza nei confronti di GFLV nelle piante transgeniche era strettamente legata alla presenza del frammento anticorpale a singola catena, a conferma del fatto che l’anticorpo era funzionale in pianta e responsabile della resistenza verso GFLV. Inoltre le piante transgeniche oltre ad una resistenza totale nei confronti di GFLV, hanno mostrato anche una resistenza parziale nei confronti di ArMV.

Il programma di resistenza a virus in vite avviato in italia


Il silenziamento genico ad RNA (“RNA silencing”) è un processo naturale di controllo dell’espressione genica”, presente in organismi animali, funghi e piante che rappresenta un meccanismo di difesa contro la presenza nella cellula di “RNA aberrante. L’RNA silencing può causare sia l’inibizione della trascrizione (transcriptional gene silencing) di un mRNA oppure la sua degradazione o ancora può bloccarne la traduzione (PTGS). All’interno della cellula gli “RNA aberranti” a doppio filamento (dsRNA) vengono tagliati ad opera di un enzima del tipo delle RNAsi III, chiamato DICER ,producendo piccoli RNA (small interfering RNA, siRNA) a doppio filamento di 21-23 nucleotidi (Zamore, 2002). Fonti di dsRNA possono essere gli RNA virali che vengono riconosciuti come estranei, ma anche intermedi aberranti provenienti da sequenze ripetitive e da RNA di trascritti con sequenze omologhe o infine piccoli RNA trascritti, che possono formare strutture secondarie con intermedi a dsRNA chiamati miRNA (microRNA) (Colombo, 2006). Nelle piante l’RNAi si diffonde da cellula a cellula molto probabilmente attraverso i plasmodesmi e a lunga distanza attraverso il sistema vascolare (Baulcombe, 2004; Voinnet, 2005). Il silenziamento ad RNA rappresenta un meccanismo di risposta alle infezioni virali evolutosi principalmente negli organismi vegetali (Baculombe, 1999) che si attiva in risposta a RNA aberranti o RNA a doppio filamento (dsRNA) che si accumulano durante la replicazione del virus. Il silenziamento del gene può essere attivato in maniera naturale dalle piante infettate dai virus o in piante transgeniche quando il transgene esprime sequenze virali (Ruiz et al., 1998). 
Uno dei motivi principali nell’utilizzo di tecniche di trasformazione genetica per conferire la resistenza contro virus nasce dall’assenza di trattamenti chimici efficaci contro le infezioni virali e la quasi totale assenza di fonti di resistenza contro la maggior parte delle principali malattie virali in piante coltivate (Beachy, 1993, Baculombe, 1994). 
Presso l’Università Politecnica delle Marche (UNIVPM) in collaborazione con l’Università di Verona (UNIVR) e Vitroplant International di Cesena si è avviato un programma di ricerca finalizzato al conferimento di una resistenza multipla a virus in vite tramite il metodo del silenziamento genico a RNA. 
Per questo obiettivo è stato realizzato un costrutto genico ad hairpin disegnato per indurre il silenziamento genico post-trascrizionale (PTGS) verso tre virus della vite: GFLV, ArMV responsabili del complesso dell’arricciamento e GLRaV associato alla malattia dell’accartocciamento fogliare. È stato dimostrato che i costrutti che esprimono in pianta trascritti a forcina, denominati hairpin RNA (hpRNA), inducono con alta efficienza il silenziamento genico (Smith et al., 2000; Wesley et al., 2001; Pandolfini et al., 2003). Gli hpRNAs contengono due regioni complementari al gene bersaglio poste in senso invertito e separate da un introne e formano una struttura a forcina contenente una regione di RNA a doppio filamento. Nel nostro costrutto le regioni ad hairpin sono state disegnate con lo scopo di silenziare i geni della RNA polimerasi RNA dipendente (RpRd) di GFLV e GLRaV3, per poter conferire una resistenza multipla a queste virosi. 
Esperimenti di trasformazione genetica sono stati realizzati su due cultivar di vite (Pinot noir e Corvina) ed un portinnesto (1103 Paulsen) applicando il metodo descritto da Mezzetti et al., (2002) su materiale vegetale di partenza, consistente in ammassi meristematici, prodotto dalla Vitroplant s.p.a. Lo sviluppo degli ammassi meristematici ha previsto esecuzione di quattro sub-colture a partire dai germogli avventizi proliferati in vitro. In ognuna delle sub-colture si è favorita la proliferazione basale e l’ipertrofia delle cellule parenchimatiche a discapito della dominanza apicale. In circa 90 giorni si è verificato il completo disseccamento ed eliminazione dell’apice attraverso la somministrazione, periodica e crescente, di N6-benzil adenina (da 4.4 µM a 13.2 µM) nel mezzo di coltura. In un intervallo di tempo abbastanza limitato, si è dunque ottenuta una massa meristematica che, una volta ripartita in piccoli frammenti (1 cm2, 2 mm di spessore) acquisisce un’alta competenza rigenerativa e diventa materiale di partenza ottimale sia per trasformazione genetica che per la micropropagazione (Figura 3).

Figura 3. Esempio di sezioni in fase di rigenerazione e selezione su terreno Vitroplant con kanamicina.
Questi tessuti vegetali sono stati utilizzati per effettuate gli esperimenti di trasformazione con il costrutto antivirale hpViruses GFLV-GLRaV. L’utilizzo delle due varietà, Corvina o Pinot noir, è motivato dal fatto di voler verificare l’efficacia del costrutto di silenziamento direttamente sulle varietà. Inoltre, poiché nelle specie in cui questo approccio è già stato sperimentato, il fenomeno della resistenza ai virus basata sul silencing ha carattere sistemico, quindi si manifesta anche nelle parti della pianta che non sono interessate inizialmente dall’infezione, si è voluto trasformare anche un portainnesto, il 1103 Paulsen, di elevato interesse commerciale per provare la possibile induzione di resistenza sistemica nelle marze. La risposta di resistenza rilevata dalle varietà transgeniche può presentare maggiori problemi di accettabilità in quanto anche il prodotto, l’uva, risulterebbe geneticamente modificato. La possibilità di avere un portainnesto transgenico capace di trasmettere la resistenza nel nesto risulterebbe di più facile valutazione per quanto riguarda i rischi, come richiesto per le piante geneticamente modificate, e conseguentemente anche per quanto riguarda l’accettabilità del consumatore. Da ricordare poi il possibile notevole vantaggio vivaistico che può derivare dalla disponibilità di un portainnesto in grado di trasmettere resistenza a virus alle principali varietà di uva da vino coltivate. 
Come risultato di questo lavoro sono risultate disponibili due putative linee transgeniche della varietà Corvina radicate che sono state analizzate tramite analisi PCR. Le due linee di Corvina, trasformate con il costrutto hpViruses GFLV-GLRaV, e radicate in kanamicina 50 mg/l, sono risultate positive all’analisi PCR utilizzando primers specifici che consentono di amplificare la sequenza di 402 bp corrispondente ad un “braccio” del costrutto hpViruses GFLV-GLRaV e i primer identificanti la sequenza (540 bp) del gene marcatore per la resistenza alla kanamicina (nptII). 

Il programma di silenziamento genico vite per lo sviluppo del frutto avviato in italia 

Un altro obiettivo che l’UNIVPM, L’UNIVR e Vitroplant si sono posti, è stato quello identificare in vite gli ortologhi dei geni AUCSIA di pomodoro e sviluppare un metodo di trasformazione genetica in vite per studiarne la funzione tramite il silenziamento genico. I geni AUCSIA di pomodoro sono espressi principalmente nelle gemme fiorali e la loro espressione è down-regolata dopo la fertilizzazione. La soppressione dei geni AUCSIA in pomodoro, ha causato lo sviluppo di frutti partenocarpici e un accumulo di auxina nelle gemme fiorali (Molesini et al.,2008), dimostrando che i geni AUCSIA di pomodoro sono coinvolti nel metabolismo delle auxine durante lo sviluppo del frutto. Lo studio degli ortologhi in vite potrebbe far luce sui processi che regolano il processo dello sviluppo del frutto in questa specie. Per questo obiettivo è stato realizzato un costrutto genico ad hairpin disegnato per indurre il PTGS verso il gene VvAUCSIA1 e sopprimerne la funzione. Il costrutto è stato utilizzato per le prove di trasformazione genetica sulla cultivar da tavola a bacca nera di Vitis vinifera Vitroblack. Il metodo di trasformazione seguito è quello descritto da Mezzetti et al., 2002, come citato in precedenza per il lavoro riguardante il silenziamento genetico in vite per la resistenza a virus. Sono state ottenute sette linee radicate (Fig. 4) che sono state analizzate tramite analisi PCR.
Figura 4: sezioni in fase di rigenerazione
e selezione su terreno Vitroplant s.p.a.
con kanamicina a 25 mg/ml

Altri esempi di applicazione delle tecniche di ingegneria genetica per il miglioramento della vite 

Gli esempi di utilizzazione dell’ingegneria genetica in vite per il miglioramento di tratti fenotipici legati alla produttività o alla resistenza agli stress abiotici sono limitati, ne riportiamo alcuni qui di seguito riguardanti la tolleranza agli erbicidi, la resistenza al freddo, all’ anossia e la regolazione della fertilità. 
Mulwa e collaboratori (Mulwa et al., 2007) hanno trasformato la cultivar Chancellor con il gene tfdA, per la tolleranza all’erbicida 2,4-D. L’erbicida 2,4-D è molto utilizzato per il controllo delle erbe infestanti e produce sulle foglie e/o sui germogli della vite segni ben marcati ed evidenti, con sintomatologia in progressione in base alla “quantità” di prodotto utilizzato. Si va da lievi e transitorie deformazioni ad effetti più marcati: le lamine fogliari si ispessiscono, i margini si ripiegano verso il basso, lo sviluppo si riduce, proseguendo poi, nella scala della gravità, si arriva ad avere veri e propri disseccamenti e distruzione dei giovani grappolini (Lorenzini, 2005). Calli embriogenetici sono stati infettati con l’A. tumefaciens portante il costrutto pAL4404::tfdA. Sono state effettuate prove di resistenza al 2,4-D (10 kg·ha-1) sulle piante trasformate, le quali hanno mostrato resistenza al prodotto. 
Poiché in alcune aree di coltivazione della vite i danni che possono essere causati dal freddo invernale sono i fattori più significativi nel limitare la produzione, Tsvetkov (Tsvetkov et al., 1998) e Goturanov (Goturanov et al., 2001), hanno sviluppato un progetto riguardante la trasformazione genetica di Vitis vinifera cultivar Rusalka, con tre differenti costrutti portanti la sequenza di un gene che codifica per una proteina di un pesce artico che ha funzioni protettive nei confronti dello stress da gelo. Le analisi PCR e southern blot, in cui stato usato il gene nptII come sonda, hanno mostrato che le piante transgeniche contengono la sequenza del gene desiderato. 
Un altro lavoro interessante è stato proposto da Tesnière e collaboratori (Tesnière et al., 2006): l’obbiettivo è stato quello di studiare in vite, il ruolo dell’alcol deidrogenasi (Adh) nello sviluppo della pianta e in risposta a stress abiotici. In vite, i geni Adh appartengono a una piccola famiglia multigenica che è stata ben caratterizzata (Tesnière e Verries, 2001; Verries et al., 2004;. Tesnière et al., 2005). Tra questi geni, il VvAdh2 è stato descritto come quello espresso durante la fase di maturazione della bacca (Tesnière e Verries, 2000). Inoltre, dati recenti suggeriscono che la regolazione dell’espressione di questo gene possa essere in parte legata al metabolismo dell’etilene (Tesnière et al., 2004). Piante di V. vinifera sono state trasformate con costrutti contenti il gene Adh2 di V. vinifera in senso o in antisenso sotto il controllo del promotore costitutivo CaMV35S. Dopo la caratterizzazione molecolare delle piante rigenerate, è stato studiato in foglie l’effetto della overespressione e del silenziamento del gene Adh2 in risposta allo stress abiotico indotto dalla carenza di ossigeno e sul contenuto di zuccheri e alcuni metaboliti secondari. Le piante che overesprimono il gene Adh2 mostravano alti livelli costitutivi dell’attività enzimatica dell’Adh2, che non aumenta comunque in condizioni di carenza di ossigeno, un contenuto minore di saccarosio e un generale aumento dei composti volatili. Le linee trasformate con il costrutto antisenso non hanno mostrato alcun cambiamento dell’attività enzimatica in condizioni di carenza di ossigeno e nel contenuto di saccarosio e metaboliti secondari. In generale non ci sono differenze significative tra le linee trasformate con il costrutto senso e antisenso per quanto riguarda il contenuto il carotenoidi e clorofilla, suggerendo una forte regolazione del metabolismo della sintesi di questi composti. 
Di particolare interesse per il miglioramento dello sviluppo della bacca è la modificazione della sintesi di auxina a livello delle gemme fiorali e delle bacche durante lo sviluppo. Utilizzando il costrutto genico DefH9-iaaM, che permette la produzione localizzata di acido indolacetico nell’ovulo e nella placenta, sono state prodotte linee transgeniche di vite che presentano aumentata fertilità, aumento del numero di acini per grappolo e variazioni nelle dimensioni degli acini (Costantini et al., 2007).

Esempi di conferimento di resistenza ai virus del pesco tramite tecniche di ingegneria genetica

Le drupacee, in particolare il pesco (Prunus persica), rappresentano le specie da frutto coltivate più importanti del bacino del Mediterraneo e anche in Italia, ma sono soggette a molte perdite agronomiche ed economiche causate da infezioni virali. Una delle malattie più virulente è rappresentata dalla Sharka, causata dal Plum Pox virus (PPV). Al momento non ci sono mezzi di lotta diretta contro tali infezioni, ma solo mezzi di prevenzione che causano grossi problemi di sostenibilità ambientale ed enormi perdite di reddito per gli agricoltori. 
Al fine di trovare una soluzione a questo problema da qualche tempo sono stati avviati programmi di miglioramento genetico tradizionali ed anche approfonditi studi genomici finalizzati in primo luogo all’identificazione di nuove fonti di resistenza e quindi di nuovi marcatori o geni di resistenza a esse associati. 
Gli obiettivi principali dei programmi di miglioramento genetico classico mirano a ottenere piante esse stesse resistenti al virus. Tuttavia, l’applicazione di tali metodologie al genere Prunus presenta molte limitazioni, tra cui i tempi lunghi di selezione, difficoltà nell’identificazione di tratti di resistenza e il trasferimento di caratteri indesiderati se si utilizzano specie diverse da quella coltivata. Per continuare con l’approccio genetico, alla luce di tali difficoltà, un’opportunità interessante sembra offerta dall’integrazione delle tecniche di breeding, con gli studi genomici ed anche con l’ingegneria genetica. 
Le tecniche di trasformazione genetica, attualmente usate per studi funzionali, potrebbero essere impiegate anche per introdurre geni di resistenza individuati in Prunus spp. o geni per il silenziamento genico post-trascrizionale (PTGS) capaci di indurre resistenza a virus. Quest’ultima tecnologia può essere utilizzata per introdurre resistenza alla Sharka in varietà e portinnesti di pesco e delle altre principali drupacee, e può essere alternativa all’induzione di resistenza con il trasferimento di geni di resistenza identificati dagli studi del genoma delle drupacee. 
Il PTGS sembra offrire maggiori opportunità rispetto all’introgressione di geni di resistenza in quanto, come è stato dimostrato in specie orticole, anche solo con il portinnesto trasformato è possibile una traslocazione del segnale molecolare capace di conferire resistenza nei tessuti innestati, garantendo quindi la produzione di frutti non geneticamente modificati e non infetti dalla malattia. Se la validità di tale metodologia venisse confermata anche per le piante legnose da frutto risulterebbe come una valida integrazione alle strategie tradizionali. Tale approccio è in ogni caso da confrontare con l’efficacia dell’espressione di geni di resistenza individuati da studi genomici avviati in Prunus. Anche in questo caso, grazie alla collaborazione avviata tra l’Università Politecnica delle Marche, l’Università di Verona e l’azienda Vitroplant di Cesena, da tempo si sta portando avanti un progetto di ricerca che ha come obiettivo l’ottenimento di piante di Prunus spp. resistenti al virus PPV attraverso l’introduzione di costrutti a forcina (hpRNA) capaci d’indurre un meccanismo di silenziamento genico post-trascrizionale. 
In realtà, tenendo conto delle difficoltà riscontrate nell’applicare i protocolli di trasformazione genetica nelle drupacee e in particolare nel pesco, specie dove tuttora non è stato possibile ottenere nuove varietà ingegnerizzate, il primo obiettivo del progetto è stato quello di sviluppare un efficiente protocollo di rigenerazione e trasformazione applicabile a varietà e portinnesti di pesco. A questo fine si è tentato di adattare in pesco il protocollo messo a punto in vite da Mezzetti et al., nel 2002., basato su un metodo di rigenerazione da tessuti somatici per organogenesi (Fig.4 A-B-C) e di trasformazione genetica mediata da Agrobacterium tumefaciens a confronto con il sistema diretto di tipo biolistico. Questi approcci sono stati applicati alla varietà Big Top ® Zaitabo* e al portinnesto GF677.
Figura 5. A) Analisi PCR delle linee transgeniche di GF677 per il vettore di controllo hp-pBin19; 1. marker molecolare, 
2. Linea GF1, 3. Linea GF2, 4. Controllo negativo. L’amplicone corrisponde a 340 paia di basi del promotore 35S; 
B) Schema illustrato del costrutto di controllo usato per trasformare piante di GF677. LB, left border; R, right border.
La biosicurezza delle piante resistenti a virus tramite l’uso del silenziamento genico

Prima che qualsiasi pianta transgenica sia rilasciata a fini della produzione commerciale, deve essere valutata in termini di sicurezza ambientale e per il suo uso alimentare e per i mangimi (food and feed). Esperti di biosicurezza dei prodotti geneticamente modificati hanno da tempo stabilito e regolamentato i sistemi di valutazione da seguire per verificare l’assenza di rischi per la coltivazione di piante e il consumo di prodotti ottenuti con i metodi dell’ingegneria genetica. 
Tutti i regimi normativi per la valutazione della sicurezza sono basati sul controllo delle informazioni presentate sulla biologia dell'organismo, la tecnologia utilizzata per crearlo, e i suoi effetti sull'ambiente e sugli organismi viventi, compresi gli esseri umani. In generale la valutazione della sicurezza di colture biotecnologiche si basa sul principio di sostanziale equivalenza (Kuiper et al. 2002; Kuiper and Kleter 2003). Ciò richiede che la coltura biotecnologica sia messa a confronto con un ‘comparator’ (controllo) scelto per la sua ‘storia di sicurezza d'uso’ cosi da valutare possibili differenze, siano esse volute o non intenzionali. Con l'attuale generazione di piante transgeniche in commercio, l’elemento cardine del processo di valutazione della sicurezza è costituito dal prodotto transgenico, che in molti casi costituisce la differenza principale tra la pianta transgenica e il suo comparatore non trasformato. In tutti questi casi, i prodotti transgenici sono proteine, e quindi sono facilmente soggetti a vari test, tra cui quello ecologico, tossicologico e a prove di allergenicità. Il silenziamento genico indotto da costrutti a forcina per la resistenza a virus in pianta, è un meccanismo non mediato da proteine, ma da molecole di RNA a doppio filamento (dsRNA). La sua applicazione a cultivar e a portinnesti di piante da frutto presenta quindi una minore esigenza di valutare i rischi rispetto alle piante GM tradizionali (Lemgo et al., 2013), e il livello di biosicurezza risulterebbe poi ulteriormente elevato con l'uso di portinnesti silenziati. Infatti, l’assenza di nuovi prodotti proteici all’interno della pianta eliminerebbe rischi a livello tossicologico e allergenico; inoltre, essendo i costrutti per il silenziamento genico disegnati in modo specifico contro sequenze del genoma virale, si ridurrebbe anche il rischio di effetti negativi verso organismi non-target. Nel caso di un portinnesto geneticamente modificato in grado di indurre resistenza alla varietà le verifiche su possibili fattori di rischio ambientali sarebbero da verificare solo nell’interazione tra suolo e radice; mentre per quanto riguarda il rischio salute potrebbero bastare studi trascrittomici e/o metabolomici capaci di dimostrare l’assenza di nuovi metaboliti prodotti dalla presenza di siRNA che dalle radici sono traslocati nel frutto. Con tali presupposti queste nuove piante transgeniche risultano facilmente accettabili soprattutto dal sistema normativo esistente negli USA e in Canada, che può riconoscere tali colture come “sostanzialmente equivalenti” ai ‘comparatori’ non trasformati. La regolamentazione in questi paesi si basa infatti sul reale rischio del prodotto e non tanto sul metodo utilizzato per ottenerlo come invece è in Europa. E’ questa diversa impostazione adottata dall’Unione Europea che rende più difficile l’approvazione di nuovi prodotti geneticamente modificati ad alto beneficio per la nostra agricoltura in assenza di rischio per l’ambiente e per la salute del consumatore. L'Autorità Europea per la Sicurezza Alimentare (EFSA), ora incaricata a fare la valutazione scientifica della biosicurezza dei prodotti geneticamente modificati, sarebbe probabilmente in grado di dare l'approvazione per la coltivazione e il rilascio in commercio di nuovi frutti ottenuti da portinnesti e cultivar resistenti a virus attraverso il meccanismo del PTGS. Tuttavia, l'influenza dell'opinione pubblica in merito all'accettazione degli OGM nell’UE ancora influenza negativamente ogni decisione definitiva per quanto riguarda la commercializzazione di questi nuovi prodotti GM. L'esempio di piante virus-resistenti, in particolare se indotte tramite un portainnesto con il meccanismo del PTGS, dovrebbe rappresentare un'importante occasione per migliorare l'accettabilità dei consumatori europei nei confronti delle piante transgeniche. Questo potrebbe avere anche importanti conseguenze per il sistema adottato dall'UE e per il sistema normativo nazionale; per la prima volta, si potrebbero sviluppare sistemi semplificati di valutazione della biosicurezza di questi nuovi prodotti. 
Un risultato di questo tipo troverebbe un immediato interesse dal sistema produttivo, in molte aree al collasso per i danni prodotti dalla Sharka, molto utile anche per avviare una discussione più concreta, su reale base scientifica, dei possibili rischi e soprattutto dei benefici derivanti dallo sviluppo ‘indigeno’ (non da multinazionali) di nuove applicazioni d’ingegneria genetica utili per risolvere importanti problemi che affliggono produzioni agricole tra le più importanti per il nostro paese.

Accettabilità e interesse per piante da frutto geneticamente modificate per la nostra agricoltura


L’applicazione delle tecnologie di modificazione genetica nelle piante solleva diverse preoccupazioni nell’opinione pubblica. In generale, le problematiche che più suscitano dibattito riguardano la sicurezza per la salute dell’uomo, per l’ambiente e soprattutto per i sistemi agricoli locali. Per quanto riguarda la salute dell’uomo, la maggiore preoccupazione è data dalla diffusione dei geni per la resistenza ad antibiotici, aspetto, questo ultimo, che per le piante da frutto è particolarmente importante per le problematiche della selezione dei rigeneranti. 
La possibilità di diffondere geni con il polline delle piante da frutto è una realtà che può interessare in modo diverso le varie specie o il tipo di pianta (chiaramente non è un problema per i portinnesti). Attualmente non ci sono possibilità concrete di controllare la dispersione di polline, se non la coltivazione in ambiente protetto. In definitiva il rischio ambientale connesso alla diffusione di polline di piante geneticamente modificate (GM) dipende dalla diffusione negli ambienti circostanti di specie autoctone compatibili, cosa non molto frequente per molte specie frutticole; tale rischio deve essere posto al pari di quello che può derivare dall’introduzione di nuove specie esotiche (Gartland et al., 2003). Il ciclo poliannuale e la propagazione clonale, non per seme, già di fatto riduce comunque rispetto alle piante annuali il rischio di diffusione nell’ambiente delle piante da frutto GM. 
Nel nostro paese, la percezione del rischio rappresentato dall’introduzione delle piante GM è spesso associata al danno che esse possono recare all’immagine delle nostre produzioni agricole di qualità e molto spesso riconosciute con marchi anche importanti. L’agricoltura del nostro paese è da molti considerata incompatibile con la tipologia di agricoltura intensiva-estensiva connessa alla agricoltura GM. Attualmente le coltivazioni GM vengono esclusivamente messe in relazione lavoro agli interessi di multinazionali straniere; è, invece, importante evidenziare che anche nel nostro paese si può favorire lo sviluppo delle biotecnologie vegetali con programmi finalizzati a risolvere problemi specifici della nostra agricoltura e quindi per la salvaguardia o maggiore competitività dei nostri prodotti (Basso et al., 2003). La vite, ad esempio, presenta delle problematiche prioritarie difficili da superare con le sole tecniche tradizionali di incrocio e selezione, quali ad esempio la suscettibilità a malattie. Tuttavia il problema principale di accettabilità non si identifica con reali rischi biologici per l’uomo o per l’ambiente, ma solo con i rischi di tipo commerciale derivanti da potenziali contaminazioni dei prodotti biologici o tipici situati in vicinanza di coltivazioni GM. In questo ambito gli studi sulla coesistenza tra questi due sistemi di produzione sono comunque di fondamentale importanza ed anche in questo le sperimentazioni di campo sono necessarie per identificare i limiti di accettabilità e diffusione di questi due sistemi di coltivazione. Da sperimentazioni effettuate in diversi paesi europei sono già disponibili dati che hanno dimostrato la possibilità della coesistenza tra questi sistemi di coltivazione.

Quadro normativo di riferimento per la sperimentazione e coltivazione delle piante OGM

L’attuale situazione regolamentare in materia d’immissione nell’ambiente (sperimentazione e commercializzazione) di organismi geneticamente modificati si identifica con un complicato quadro giuridico. Nel 2001, la Commissione Europea, nell’intento di offrire un approccio affidabile e sicuro sugli OGM, ha approvato un importante pacchetto legislativo che traccia un sistema di controlli e regole per la sperimentazione, il commercio e l’etichettatura di tali prodotti allo scopo di regolarne la loro immissione in ambiente confinato ad uso sperimentale ma anche sul mercato, attraverso una specifica procedura di autorizzazione (vedi direttiva 2001/18/CE). Nel nostro Paese la normativa nazionale di riferimento è stata aggiornata con la pubblicazione nella G.U.R.I. del Decreto Legislativo nr. 224 in data 8 luglio 2003 (che ha recepito la dir. 2001/18/CE). Il D.L. No. 224 è stato poi completato dal recente D.L. No. 5 (28/01/05), predisposto dal ministero dell’Agricoltura, che tende a garantire una possibile coesistenza tra coltivazioni GM e i sistemi di coltivazione tradizionali, rispetto alla quale le singole Regioni erano tenute, entro Giugno 2006, ad aderire con la presentazione di un loro piano di coesistenza che deve prevedere, in primo luogo, l’identificazione di siti pubblici ufficiali dove poter attivare la sperimentazione. Purtroppo tutto questo non è stato fatto. 
Il provvedimento normativo comunitario ed il corrispondente recepimento nazionale si articola in quattro parti: la parte A contiene le disposizioni principali, quella B regola l’immissione nell’ambiente - a scopi sperimentali - di organismi geneticamente modificati, la successiva parte C disciplina la relativa immissione in commercio, conseguente ad una decisione comunitaria, infine nella parte D sono contemplate le disposizioni finali, poi integrate con la richiesta per ogni notifica di specifici piani di sicurezza e di monitoraggio. 
La normativa nazionale non ha il solo scopo di proteggere la salute umana e l’ambiente dai potenziali rischi in caso di emissione sperimentale o immissione sul mercato di organismi transgenici, ma, quale elemento di novità non direttamente contemplato nella Direttiva 2001/18/CE, di tutelare l’agrobiodiversità, i prodotti tipici, biologici e di qualità. Inoltre, rispetto alla normativa nazionale di attuazione della precedente Direttiva, l’Autorità competente cui è affidata la gestione del settore transgenico passa dal Ministero della Salute (a cui resta la competenza sui microrganismi transgenici) a quello dell’Ambiente e della Tutela del Territorio, con il ruolo di coordinare la Commissione Interministeriale di Valutazione (CIV), l’organo tecnico che deve elaborare i pareri sulle notifiche (tipo B – sperimentazione e tipo C commercializzazione). 
Le notifiche per la sperimentazione di piante GM devono essere finalizzate ad una completa valutazione agronomica delle caratteristiche delle piante geneticamente modificate, non solo per i possibili rischi, ma soprattutto per i possibili benefici che possono derivare dalla coltivazione dei nuovi genotipi modificati per singoli geni che possono determinare importanti miglioramenti quantitativi e qualitativi della produzione. 
Il recepimento della normativa comunitaria è avvenuto nel 2003, ma al 2015 non si è ancora giunti alla applicazione utile per avviare nuove sperimentazioni su piante GM in Italia, perché ancora non è stato trovato un accordo tra Ministero Agricoltura e Conferenze Stato e Regioni sui protocolli da adottare per garantire una maggiore sicurezza nella realizzazione delle sperimentazioni. 
In questi anni le attività di valutazione della CIV sono quindi state sospese. L’ultima notifica di sperimentazione in campo è stata presentata nel 2005 dall’Università di Catania per nuove piante di limone GM per la produzione di una endochitinasi capace di conferire resistenze a importati tracheomicosi degli agrumi. La valutazione scientifica realizzata dagli esperti della CIV risultò a favore dell’avvio della sperimentazione ma per la mancanza della firma sui protocolli richiesti dall’allora decreto Alemanno la sperimentazione non fu più autorizzata ed avviata. Da allora nessun ricercatore ha tentato di presentare altre notifiche per sperimentazioni in campo in quanto tutti consapevoli che pur essendoci direttive comunitarie ben chiare in realtà la procedura di autorizzazione risultava bloccata. Ciò a favore di assurde propagande su strabilianti strategie protezionistiche per settori ancora marginali della nostra agricoltura lasciando alla deriva altri settori storicamente molto importanti. 
Questa situazione di non applicazione delle normative comunitarie è un forte elemento di incoerenza del nostro paese legato all’incapacità della nostra comunità scientifica a far valere la ragione dell’importanza di continuare con la ricerca e la sperimentazione nelle biotecnologie per risolvere importati criticità delle nostre produzioni agricole. 

Prospettive 

La trasformazione genetica è tra le tecniche biotecnologiche a supporto del miglioramento genetico quella che presenta le più elevate potenzialità sia perché consente di superare molti dei limiti che si incontrano operando con i metodi tradizionali di miglioramento genetico sia perché i tempi di realizzazione degli stessi programmi si riducono fortemente. 
Dal 1998 in Italia come in Europa a causa delle varie decisioni politiche, il numero delle notifiche di sperimentazioni in campo di piante GM ha subito una continua riduzione (Masciarelli et al., 2004) fino a limitarsi a soli due campi autorizzati, presso l’Università della Tuscia e presso l’Università Politecnica delle Marche. Si è poi arrivati all’estirpazione e rogo delle piante dei campi di Viterbo e di Ancona e al blocco dell’avvio della sperimentazione approvata dalla CIV poi resa inapplicabile per il limone resistente a tracheomicosi prodotto dell’Università di Catania. Questa realtà è molto significativa del livello di carenza che si è creata nel nostro paese sulle conoscenze necessarie per una valutazione coerente, su base scientifica, dei possibili rischi, benefici e della reale utilità delle piante GM per la nostra agricoltura. A ciò è corrisposto un forte indebolimento nel sistema di valutazione e soprattutto di acquisizione e trasferimento delle competenze necessarie per l’applicazione corretta, competitiva e mirata alle esigenze della nostra agricoltura delle tecniche innovative di biologia molecolare, dall’ingegneria genetica al gene editing. 
In questo scenario scientifico così avvilente si può rilevare di positivo che, soprattutto a livello nazionale, la poca ricerca che è continuata si è concentrata particolarmente su diverse specie di interesse per le produzioni orto-floro-frutticole (Masciarelli et al., 2004). I risultati rilevabili per le piante da frutto, in particolare, sono da prendere ad esempio per come queste tecniche molecolari devono essere considerate validi strumenti integrativi al ‘breeding’ tradizionale e per il ruolo fondamentale della sperimentazione in campo per fornire conoscenze su benefici e rischi dell piante GM.
L’accettabilità futura di piante e prodotti GM dipende solamente dalla continuità della ricerca che deve operare per migliorare le tecniche di trasformazione genetica, per individuare e sperimentare geni di interesse connessi alla risoluzione di problematiche specifiche dei nostri sistemi produttivi con la completa assenza di rischi per l’uomo e per l’ambiente. Tale aspetto è particolarmente importante per le specie arboree da frutto se si considerano la notevole complessità fisiologica della pianta e il lungo ciclo delle coltivazioni, fattori che rendono più complessi i problemi connessi alla stabilità dell’espressione del transgene. 
L’unico esempio di diffusione commerciale di pianta da frutto GM è la papaya resistente a virus, avanzata è anche la richiesta di autorizzazione commerciale per il susino resistente a Sharka, e particolare attenzione sembra essere indirizzata a meli transgenici resistenti a patogeni ottenuti grazie all’introduzione di geni isolati dalla stessa specie (cisgenici). In un prossimo futuro la disponibilità di nuovo materiale ottenuto con questa tecnologia è destinato ad aumentare enormemente, grazie in particolare alle conoscenze derivanti dal sequenziamento del genoma di molte specie, tra cui vite, melo e pesco, già disponibili, olivo e clementine di prossima realizzazione, ed anche allo sviluppo di nuove tecnologie utili per migliorare l’efficienza e il controllo degli eventi di ingegneria genetica. 

Bibliografia

Baulcombe DC (1999). Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing. Curr. Opin. Plant Biol. 2, 109-113.
Baulcombe D (2004) RNA silencing in plants. Nature 431:356–363.
Bardonner N, Hans F, Serghini MA and Pinck L (1994). Protection against virus infection in tobacco plants expressing the coat protein of grapevine fanleaf nepovirus. Plant Cell Re. 13, 357-360.
Costantini E, Landi L, Silvestroni O, Pandolfini P, Spena A and Mezzetti B (2007). Auxin Synthesis-Encoding Transgene Enhances Grape Fecundity. Plant Physiology, Vol. 143, pp. 1689–1694.
Di Nicola-Negri E, Tavazza M, Salandri L, Ilardi V (2010) Silencing of Plum pox virus 50UTR/P1 sequence confers resistance to a wide range of PPV strains Plant Cell Rep 29:1435-1444.
Ding S, Voinnet O (2007). Antiviral Immunity Directed by Small RNAs. Cell 130: 43-426.
Dunoyer P, Christopher A, Brosnan CA, Schott G, Wang Y, Jay F, Alioua A, Himber C, Voinnet O (2010). An endogenous, systemic RNAi pathway in plants The EMBO Journal 29:1699-1712.
Eamens A, Wang MB, Smith NA, Waterhouse PM (2008). RNA Silencing in Plants: Yesterday, Today, and Tomorrow. Plant Physiology 147:456-468.
Frizzi, A and Huang S (2010). Tapping RNA silencing pathways for plant biotechnology. Plant Biotechnol. J. 8: 655-677.
Flavell RB (1994) Inactivation of gene expression in plants as a consequence of specific sequence duplication. Proc Natl Acad Sci USA 91:3490–3496.
Fuchs M, (2003). Transgenic resistance: state of the art and perspectives. Extended abstracts of the 14th Meeting of ICVG, Locorotondo, 2003: 221-223.
Fuchs M and Gonsalves D (2007). Safety of virus-resistant transgenic plants two decades after their introduction: lessons from realistic field risk assessment studies. Annu. Rev. Phytopathol 45:173 – 202.
Fuchs M and Gonsalves D (2007). Safety of virus-resistant transgenic plants two decades after their introduction: lessons from realistic field risk assessment studies. Annu. Rev. Phytopathol 45:173 – 202.
Gambino G, Perrone I, Carra A, Chitarra W, Boccacci P, Torello Marinoni D, Barberis M, Maghuly F, Laimer M, Gribaudo I (2010). Transgene silencing in grapevines transformed with GFLV resistance genes: analysis of variable expression of transgene, siRNAs production and cytosine methylation. Transgenic Res 19:17–27.
Harada T (2010). Grafting and RNA transport via phloem tissue in horticultural plants. Scientia Horticulturae 125:545-550.
Hily JM, Ravelonandro M, Damsteegt V, Basset C, Petri C, Liu Z, Scorza R (2007). Plum pox virus coat protein gene intron-hairpin-RNA (ihpR NA) constructs provide resistance to plum pox virus in Nicotiana bethamiana and Prunus domestica. J Am Soc Horti Sci 132:850-858.
Jagtap UB, Gurav RG, Bapat VA (2011). Role of RNA interference in plant improvement. Naturwissenschaften 98:473-492.
Jamoussi RJ, Winterhagen P, Bouamama B, Dubois C, Mliki A, Wetzel T, Ghorbel A, Reustle G (2009). Development and evaluation of a GFLV inverted repeat construct for genetic transformation of grapevine. Plant Cell Tiss Organ Cult 97:187–196.
Jardak-Jamoussi RJ, Winterhagen P, Bouamama B, Dubois C, Mliki A, Wetzel T, Ghorbel A, Reustle G (2009). Development and evaluation of a GFLV inverted repeat construct for genetic transformation of grapevine. Plant Cell Tiss Organ Cult 97:187-196.
Jones JDG and Dangl JL (2006). The plant immune system. Nature Vol 144.
Kanehira A, Yamada K, Iwaya T, Tsuwamoto R, Kasai A, Nakazono M, Harada T (2010). Apple phloem cells contain some mRNAs transported over long distances. Tree Genetics & Genomes 6:635-642.
Kortekamp A (2006). Expression analysis of defence-related genes in grapevine leaves after inoculation with a host and a non-host pathogen. Plant Physiology and Biochemistry 44, 58-67.
Kuiper HA, Kleter GA, Noteborn HPJM, Kok EJ (2002) Substantial equivalence—an appropriate paradigm for the safety assessment of genetically modified foods? Toxicology 181–182:427–431.
Kuiper HA, Kok EJ, Engel KH (2003) Exploitation of molecular profiling techniques for GM food safety assessment. Curr Opin Biotechnol 14:238–243.
Lemgo GNY., Sabbadini S, Pandolfini T, Mezzetti B (2013) Biosafety considerations of RNAi-mediated virus resistance in fruit-tree cultivars and in rootstock. Transgenic Res. DOI 10.1007/s11248-013-9728-1.
Ling KS, Zhu HY, Gonsalves D (2008). Resistance to Grapevine leafroll associated virus-2 is conferred by post-transcriptional gene silencing in transgenic Nicotiana benthamiana. Transgenic Res 17:733-740.
López C, Cervera M, Fagoaga C, Moreno P, Navarro L, Flores R,Peña L (2010). Accumulation of transgene-derived siRNAs is not sufficient for RNAi-mediated protection against Citrus tristeza virus in transgenic Mexican lime. Mol Plant Pathol 11:33-41.
Maghuly F, Leopold S, Machado ADC, Fernandez EB, Khan MA, Gambino G, Gribaudo I, Schart JA, Laimer M, (2006). Molecular characterization of grapevine plants transformed with GFLV resistance genes: II. Plant Cell Reports 25: 546-553.
Melnyk CW, Molnar A, Baulcombe DC (2011). Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. The EMBO Journal 30, 3553-3563.
Mezzetti B, Pandolfini T, Navacchi O, Landi L, (2002). Genetic transformation of Vitis vinifera via Organogenesis. BMC Biotechnology 2:18.
Molesini B, Pii Y, Pandolfini T (2012). Fruit improvement using intragenesis and artificial miRNA. Trends in Biotechnology 30 ( 2):80-88.
Molnar A, Melnyk CW, BassettA, Hardcastle TJ,Dunn R, Baulcombe DC (2010). Small Silencing RNAs in Plants Are Mobile and Direct EpigeneticModification in Recipient Cells. Science 328, 872-875.
Palma D, Girolomini L, Pandolfini T, Navacchi O and Mezzetti B (2010). “Regeneration and Genetic transformation via- Organogenesis of diferent varietie of Vitis vinifera and Prunus persica” IHC, Lisboa.
Pandolfini T, Molesini B, Avesani L, Spena A, Polverari A. (2003). Expression of self-complementary hairpin RNA under the control of the rolC promoter confers systemic disease resistance to plum pox virus without preventing local infection. BMC Biotechnology, 3:7.
Perl A and Eshdat Y, (1998). DNA transfer and gene expression in transgenic grapes. In: Tombs, M.P. (ed). Biotechnology and genetic engineering reviews vol. 15. Intercept Ltd. Andover, pp. 365-389.
Perl A, Sahar N, Farchi SH, Colova-Tsolova V, Holland D and Golop R, (2000). Conventional and biotechnological breeding of seedless table grapes in Israel. 6th International symposium on Grapevine Physiology and Biotechnology, Greece.
Simón-Mateo C, García JA (2011). Antiviral strategies in plants based on RNA silencing. Biochim Biophys Acta. 1809:722-31.
Tesniere C, Torregrosa L, Pradal M, Souquet JM, Gilles C, Dos Santos K, Chatelet P, and Ziya Gunata (2006). Effects of genetic manipulation of alcohol dehydrogenase levels on the response to stress and the synthesis of secondary metabolites in grapevine leaves. Journal of Experimental Botany, Vol. 57, No. 1, pp. 91–99.
Tournier B, Tabler M, Kalantidis K (2006). Phloem flow strongly influences the systemic spread of silencing in GFP Nicotiana benthamiana plants. The Plant Journal 47, 383-394.
Vivier MA, Becker J, Carstens M, De Ascensao A, De Beer A, Marais E and Pretorius IS (2000). Engineering fungal resistance in grapevine (Vitis vinifera). 6th International Symposium on Grapevine Physiology and Botechnology Greece.
Voinnet O (2005). Induction and suppression of RNA silencing: insights from viral infections. Nature Rev. Genet., 6:206-220.
Waterhouse PM, Graham MW, Wang MB (1998). Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA. Proc Natl Acad Sci USA 95:13959- 13964.
Waterhouse PM & Helliwell CA (2003) Exploring plant genomes by RNA-induced gene silencing. Nature Rev. Genet. 4:29–38.
Yan H, Chretien R, Ye J, Rommens CM (2006). New construct approaches for efficient gene silencing in plants. Plant Physiol. 141, 1508-1518.
Yoo B, Kragler F, Varkonyi-Gasic E , Haywood V, Archer-Evans S, Moo Lee Y, Lough TJ, Lucas WJ (2004). A Systemic Small RNA Signaling System in Plants. The Plant Cell, 16, 1979-2000.
Zamore PD (2002). Ancient pathways programmed by small RNAs. Science Vol. 296, 1265-1269.



Bruno Mezzetti
Docente, Genetista agrario presso l’Università Politecnica delle Marche, 
Facoltà di Agraria. E' stato Direttore del Dipartimento di Scienze Agrarie, 
Alimentari ed Ambientali dello stesso Ateneo. 
Email: b.mezzetti@univpm.it



Silvia Sabbadini
Dipartimento di Scienze Agrarie, Alimentari ed Ambientali (D3A), Università Politecnica delle Marche 
Oriano Navacchi
VITROPLANT, Cesena, Italy
Tiziana Pandolfini
Dipartimento di Biotecnologie, Università di Verona. Email: tiziana.pandolfini@univr.it

2 commenti:

  1. Alberto Guidorzi29 novembre 2015 00:37

    Prima parte

    Ho letto e riletto quanto ci riporta il Prof. Mezzetti, anzi me ne complimento per la tenacia di portare avanti un lavoro ostracizzato e senza certezze di sbocchi pratici. Nello stesso tempo la lettura mi ha portato a fare delle riflessioni che esterno in questo commento.

    Sarebbe molto semplice da capire cos’è avvenuto in poco più di mezzo secolo se si riflettesse sul perché il cibo, purtroppo solo nel mondo sviluppato, rappresenti per le nostre società una parte non dico marginale, ma quasi, dei nostri bilanci famigliari.

    Abbiamo semplicemente accumulato parte della variabilità genetica naturale presente nelle piante coltivate, in varietà nuove. Altro che perdita di biodiversità! La biodiversità l’abbiamo grandemente moltiplicata: il pomodoro San Marzano, altri purtroppo e non noi, lo hanno ricreato sotto forma di una miriade di varietà nuove e migliori.

    Ora siamo arrivati al punto che la variabilità genetica non ancora sfruttata è più difficile da scoprire e da usare, o meglio la si scopre e la si può usare con metodologie molto più complesse e costose, facendo divenire la creazione varietale non più alla portata degli stessi soggetti che agivano prima. La concentrazione nella creazione varietale è stato un fatto ineluttabile per due motivi: - la politica non ne ha capito la strategicità per una nazione e ha tarpato le ali alla ricerca pubblica, - gli operatori sementieri tradizionali, di fronte ad investimenti troppo onerosi, o ha chiuso, o, se era appetibile per il suo know how, ha preferito vendersi.

    Inutile scandalizzarsi della nascita delle multinazionali, è stata un’evoluzione logica e soprattutto avvenuta alla luce del sole, ma nel disinteresse generale. Ora si tratta di controllarne l’operato, il che non vuol dire impedirgli di lavorare.

    RispondiElimina
  2. Alberto Guidorzi29 novembre 2015 00:38

    Seconda parte e continuo

    Purtroppo questo non è compreso, anzi sembra che l’oscurantismo avanzi; gli esempi e le realizzazioni del Prof Mezzetti dimostrano che la ricerca pubblica non può svolgere il proprio lavoro o per lo meno non lo può finalizzare e che la nostra creazione varietale privata è totalmente scomparsa, lasciandoci alla mercé, dell’importazione di sementi per il noistro fabbisogno proprio da quelle multinazionali che tanto critichiamo.

    E l’UE cosa fa? Beh qui siamo al paradosso se stiamo a quanto contenuto nel parere giuridico dato alla Commissione nel campo ben delineato dal Prof Mezzetti e che non è ancora legislato in tutte le sue implicazioni e sfaccettature. Riassumo: la direttiva che definisce un organismo geneticamente modificato è la 2001/18/EC, solo che si occupa di tecniche biologiche nate in parte 70 anni fa e le più sofisticate sono di 30 anni fa. Solo che nel 2001, anno della Direttiva appunto, e visti i limiti fissati, esistevano già piante coltivate da decenni che sarebbero state proibite e pure delle tecniche ormai di routine che sarebbero state interdette. Ecco allora che la politica pensò bene di fare delle eccezioni affinchè non si ricadesse nel controsenso di proibire qualcosa di consolidato e non per motivi obiettivi, ma solo perché si era imposta una definizione che non teneva conto della realtà. Lo stesso paradosso si sta presentando ora in quanto in questi ultimi 15 anni vi è stata un’esplosione di scoperte e tecniche biotecnologiche che hanno messo in crisi ulteriormente la direttiva precedente e reso la definizione impotente a regolamentare il nuovo. Sono le tecniche descritte dal Prof. Mezzetti e tante altre, che, per chi le volesse conoscere, le può visionare in questo documento divulgativo:
    http://www.salmone.org/wp-content/uploads/2015/07/guidorzi.pdf
    E’ dal 2008 infatti che la Commissione UE è stata incaricata di occuparsi della materia, ma essendo essa scottante non ne ha ancora fatto nulla. Solo che il tempo corre, le implicazioni di ordine economico sono grandissime e si stanno creando le premesse per creare veri e propri impedimenti alla libera circolazione delle merci in spregio a trattati internazionali già firmati.
    Ne diamo un esempio: il comprendere o meno una nuova varietà di pianta coltivata, ottenuta con una delle nuove tecnologie, nelle restrizioni della direttiva del 2001 significa poterla commercializzare previa spesa di circa 136 milioni $ per l’omologazione o risparmiarli del tutto.

    A Bruxelles si sta combattendo una battaglia accanita tra comunità scientifica, industria delle sementi e rappresentanti degli agricoltori da una parte e organizzazioni ambientaliste dall’altra che puntano al ritorno della creazione varietale di 100 anni fa.
    Si pensi solo che negli scorsi mesi il panel di esperti giuridici dell’UE ha detto che a suo parere e stante la definizione del 2001, non solo sono da considerarsi tecniche OGM tutte le nuove, ma anche le vecchie tecniche biotecnologiche che la politica aveva escluso per motivi di opportunità. Quindi, stante il parere, al bando tutte le varietà derivate da mutagnesi e da altre biotecnologie vecchie di 40 anni e che una generazione di consumatori ha mangiato. I singoli Stati sono divisi su quale interpretazione dare, vista una opinione pubblica che hanno contribuito a disinformare, e quindi la Commissione UE è impotente e rimanda la decisione.
    Il mio parere comunque è che la si deve smettere di regolamentare in funzione delle tecniche usate per costituire una varietà vegetale e passare a decidere di valutare esclusivamente il prodotto finale indipendentemente dalle tecniche usate anche perché la scienza ci sta dicendo che le tecniche che noi consideriamo artificiali e da bandire una volta o l’altra le ha usate la natura. E’ recente l’esempio della patata dolce e di tante altre piante coltivate. Ma ad un falegname imponiamo di costruire un uscio come lo faceva suo nonno perché altrimenti userebbe strumenti più pericolosi per la sua incolumità?



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